检测技术-基于高分辨液质检测技术筛查与确证饲料产品中非法添加化学物质的研究

基于高分辨液质检测技术筛查与确证饲料产品中非法添加化学物质的研究

◆作者：刘燕   林海丹*

◆单位：广东省农产品质量安全中心（广东省绿色食品发展中心）

摘要：本研究建立了饲料中104种药物及其化合物的高分辨质谱库及筛查确证方法，基于高分辨液质（UPLC-Q-Orbitrap HRMS）检测技术，优化验证色谱柱和仪器参数，采集扫描模式，获取保留时间、母离子精确质量数和二级特征碎片离子精确质量数，建立靶向药物及其化合物104种的筛查数据库。优化验证各类饲料产品的前处理方法，采用UPLC-Q-Orbitrap HRMS测定，利用Trace Finder软件将样品数据与筛查数据库进行匹配，实现靶向目标物的高通量筛查确证。该方法基本满足饲料产品中非法添加化学药物的高通量快速检测，为饲料质量安全监控提供技术支撑。

关键词：高分辨质谱库；筛查与确证；非法添加；饲料

高效液相色谱－飞行时间质谱（Q-TOF）和静电场轨道离子阱质谱（QE）等高分辨质谱在饲料中风险化学物质的筛查显示出了高分辨质谱高通量、高准确性的优势。自农业农村部发布246号、307号和194号等公告后，分别从商品饲料禁抗、自配料禁抗和禁抗后部分畜禽抗球虫药的使用等方面做出相关规定。因此，亟需建立一个系统的高通量、高效率的筛查方法，有针对性地对商品饲料和养殖过程中饲料添加禁停用药物和其他非法添加的化学物质进行风险排查，可有效提高预警工作效率，有利于全面提高应对饲料质量安全风险的能力和效率。

1 材料与方法

1.1试剂

甲醇、乙腈均为色谱纯，德国Merck公司；实验用水符合GB/T 6682规定的一级用水；甲酸，上海安谱科技股份有限公司；104种兽药及化合物标准品，天津阿尔塔科技有限公司。

1.2仪器设备

超高效液相色谱-四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱联用仪（UPLC-Q-Exactive Orbitrap），赛默飞世尔科技公司；全自动智能氮吹仪（FV64型），广州得泰仪器科技有限公司；涡旋混合器（MS3），德国IKA公司；振荡器（HS501），德国IKA公司；高速冷冻离心机（3K15），德国SIGMA公司；电子天平（BCE55i- 10CN），赛多利斯公司。

1.3试验方法

1.3.1液相条件

色谱柱：AccucoreTM（2.1mm×100mm，2.6μm）；柱温：30℃。流动相A为0.1%甲酸甲醇；B为0.2%甲酸水溶液；采用液相梯度洗脱程序为：0—15.0min，5%A-95%A；15.0—17.0min，95%A；17.0—17.1min，95%A-5%A；17.1—20.0min，5%A。流速：0.30mL/min；进样量：4μL。

1.3.2质谱条件

离子源：HESI-II；扫描方式：Full MS/dd-MS2 ；源区主要参数：Probe位置是C；鞘气40arb；辅助气10arb；喷雾电压3.5kV；离子传输管温度320℃；脱溶剂温度350℃；碰撞能量20、40、60eV；扫描范围（m/z）120—1200。采集数据前使用校正液进行质量轴校正。采集数据通过Xcalibur软件提取化合物保留时间、母离子精确质量数和二级碎片离子质量数等信息，通过Trace Finder建立筛查数据库。

1.3.3试样前处理

称取2g（精确至0.01g）试样置50mL离心管中，加入10mL 0.2%甲酸（乙腈∶水=80∶20）提取溶液，涡旋，振摇，超声，高速离心，取上清液，重复提取，合并上清液，混匀，取合并液适量，将提取液稀释至适当浓度。

取6mL稀释液经通过固相萃取柱，收集5mL流出液，40℃氮吹至近干，用1mL 10%乙腈水复溶，涡旋，高速离心，上清液过0.22μm滤膜，装瓶，上机。

1.3.4筛查结果判定

依据《饲料中风险物质的筛查与确认导则液相色谱-高分辨质谱法（LC-HRMS）》农业农村部公告第312号附件，经预处理后的样品，在Full MS/dd-MS2 模式下进行测定，得到保留时间、母离子精确质量数和二级碎片离子质量数，与目标物谱库相匹配。对于初步鉴别出的疑似阳性药物，在PRM模式下检测其在不同碰撞能量下典型的二级碎片离子，如果至少有两个丰度较高的碎片离子与谱库中相应的碎片离子质量数偏差小于10ppm，且上述二级碎片离子与浓度接近的标准工作液中对应的碎片离子的相对丰度一致，且平行试验结果一致的情况下，可判定为试样中存在这种兽药或化合物。

2 结果与分析

2.1 数据库的建立

购买养殖中常用的磺胺类、氟喹诺酮类、激素类、大环内酯类、四环素类等药物及其化合物的标准品16类104种。按照1.3的试验方法对标准品进行分析，结果显示：本实验液相条件下20min洗脱梯度全部化合物可洗脱，并且全部化合物出峰形态较好；104种药物及其化合物在50ng/mL混合浓度下同时检出。质谱采用Full MS/dd-MS2模式进行数据采集，获取保留时间、母离子精确质量数和二级特征碎片离子精确质量数。利用Trace Finder软件建立数据库，内容包括：化学物质中文名称、英文名称、分子式、CAS、保留时间（RT）、母离子精确质量数和二级特征碎片离子精确等。（部分药物）具体信息见表1。

2.2添加阳性样品筛查结果

按照本文建立的方法对空白样品添加标准物质进行快速筛查试验，标准添加水平分别为10、20、100ng/g，结果显示：100ng/g标准添加下可筛查确证出全部药物及其化合物104种，20ng/g标准添加下可筛查确证出药物及其化合物96种，10ng/g标准添加下可筛查确证出药物及其化合物77种。在饲料中主观添加药物以发挥促生长和抗病作用，其添加浓度不会低于此。该方法可满足饲料产品中非法添加药物或化合物的高通量快速检测的需求。

2.3实际样品筛查

自2018年，在全省范围内开展饲料质量安全风险预警监测工作以来，应用该方法进行   32 000批次饲料筛查确证分析，结果为：

①在猪配合饲料、自配料以及水产品商品饲料中检出环丙氨嗪，环丙氨嗪是一种高效的昆虫生长抑制剂；②在禽饲料中筛查检出驱虫药：二硝托胺、尼卡巴嗪、氯羟吡啶、甲基盐霉素等，检测结果显示存在超范围使用驱虫药物，在猪、水产品、鸭、鹅等饲料中的检出，均属于超范围使用；③在商品饲料中检出微量多种类抗生素（磺胺类、氟喹诺酮类、林可胺类、大环内酯类等），较突出的问题是在饲料产品中检出微量氟苯尼考的情况比较多。

3 结论

应用本实验方法处理饲料样品、采集数据并分析，快速准确，人员投入少，可提高检测饲料中化学风险物质的效率，实现大批量处理、筛查和确认。随着收集的非法添加化学物进一步增加，饲料各类样品的前处理方法进一步优化，相关数据库中药物及其化合物的种类和数量会不断增加，筛查范围和效率将进一步明显提升，从而使饲料中添加非法添加物的不法行为无处遁形，为保障饲料质量安全，促进健康养殖发挥重要作用。

参考文献：

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